Методи дослідження збудливих мембран
Структура за темами
-
Курс «Методи дослідження збудливих мембран» є ключовим для опанування студентами сучасними методологічними підходами і фізичними приладами, що широко застосовуються в експериментальній біофізиці для дослідження транспортної та сигнальної функції клітинних мембран. Він ставить за мету розвиток у студентів навичок постановки електрофізіологічного експерименту, реєстрації біоелектричних явищ, обробки та інтерпретації одержаних результатів. Передбачається вивчення механізмів біоелектрогенезу, принципів збору та анализу електрофізіологічної інформації на макро та мікрорівнях, підходів до клонування, функціональної експресії та структурно-функціональному анализу мембранних іонних каналів та рецепторів, а також основ флуорисцентної та конфокальної мікроскопії.
Метою курсу «Методи дослідження збудливих мембран» є ознайомлення студентів з теоретичними та експериментальними підходами, які лежать в основі дослідження біоелектричної функції клітинних мемран. Вивчення курсу є необхідним етапом для закладання бази подальшої спеціалізації.
Завданням курсу є розуміння студентами теоретичних засад та опанування ними ключовими методичними підходами, які застосовуються для дослідження іон-транспортної та сигнальної функції клітинних мембран.
Інтегровані вимоги до знань та вмінь по учебовому курсу полягають в тому, що в результаті його вивчення студент повинен:
Знати:
- механизми виникнення біоелектрики та властивості біомембран;
- вимоги та принципи побудови електрофізіологічної апаратури та установки;
- фізичну хімію поведінки металів та скла в електролітах;
- принципи виготовлення та роботи електродів та мікроелектродів;
- загальні методичні підходи для електрофізіологічного дослідження клітин;
- існуючі експериментальні методики електрофізіологічного дослідження різних типів клітин та багатоклітинних препаратів;
- принципи збору, аналізу та обробки електрофізіологічної інформаціїи на макро та мікрорівнях;
- підходи до клонуванню, функціональній експресії та структурно-функціональному аналізу мембранних каналів та рецепторів;
- властивості експресійних систем для функціонального анализу клонованих каналів та рецепторів;
- використання флуорисцентних зондів для візуалізації та кількісної характеристики внутрішньоклітинних структур, біологічно активних речовин та процесів;
- основи флуорисцентної та конфокальної мікроскопії;
Вміти орієнтуватися та використовувати сучасний арсенал методичних подходів для дослідження клітинних мембран.
Місце в структурно-логічній схемі спеціальності. Вивчення дисципліни «Методи дослідження збудливих мембран» базується на засадах інтеграції теоретичних та практичних знань, отриманих студентами як в загальноосвітніх навчальних закладах (природознавство, фізика, хімія, біологія та цивільна оборона), так і одержаних при вивченні дисціплін на попередніх курсах навчання (анатомія та фізіологія, основи молекулярної фізіології).
-
3.1. Молекулярно білогічні підходи до дослідження іонних каналів та рецепторів – 1 год.
Генетичний код та його звязок з первинною структурою білка. Біохімічне виділення мембранних білків. Способи клонування іонних каналів та рецепторів. Бібліотеки геномної та комплементарної ДНК. Вектори ДНК.
На самостійне опрацювання студентами виносяться проблеми (3 год.)
1. Екзони та інтрони геномної ДНК
2. Сплайсинг та редагування мРНК.
3.2. Попередній аналіз клонованих каналів та рецепторів – 1 год.
Виведення первинної структури клонованого канала. Профіль гідропатичності та його звязок з топологією мембранного білка. Ідентифікація транс- та позамембранних ділянок. Змійчасті діаграми. Дендрограми гомологічних каналів.
На самостійне опрацювання студентами виносяться проблеми (3 год.)
1. Природа різноманіття однотипних каналів: гомологічні гени, альтернативний сплайсинг та редагування мРНК.
2. Метод заміщених цистеїнів.
3.3. Структурно-функциональний аналіз клонованих каналів та рецепторів – 2 год.
Основні родини клонованих каналів та рецепторів. Гомо- та гетеромультимерні канали. Ідентифікація функціонально важливих ділянок. Внесення мутацій та функціональна експресія клонованих каналів та рецепторів.
На самостійне опрацювання студентами виносяться проблеми (2 год.)
1. Основні класи та родини іонних каналів.
2. Пороутворювальні та службові субодиниці каналів.
3. Структурні ознаки потенціалкерованих каналів.
3.4. Характеристика систем для функціональної експресії экзогенних каналів та рецепторів – 1 год.
Іморталізовані клітинні лінії, їх одержання та культивування. Ооцити шпорцевої жаби Xenopus laevis, їх морфологія, процедура виділення та культивування.
На самостійне опрацювання студентами виносяться проблеми (1 год.)
1. Критерії вибору клітинних ліній, основні світові банки клітинних ліній.
2. Особливості лабораторного утримання шпорцевої жаби Xenopus laevis.
3.5. Методи введення генетичного материалу в експресійні системи – 2 год.
Способи трансфекції екзогенної ДНК в клітинні лінії. Маркери трансфекції. Транзієнтна та стабільна трансфекція. Інжекція сумарної мРНК, виділеної з різних тканин, та комплементарної мРНК клонованих каналів в ооцити Xenopus.
На самостійне опрацювання студентами виносяться проблеми (2 год.)
1. Зелений флуорисцентний білок та його похідні.
2. Умовна трансфекція.
3.6. Электрофізіологічні методи дослідження експресованих каналів та рецепторів – 1 год.
Електричні параметри ооцитів Xenopus. Двух-МЕ фіксація потенцалу на ооцитах Xenopus та її особливості. Методика "зрізаного ооцита". Метод скляної воронки для внутрішньоклітинної перфузії та фіксації потенциалу ооцитів Xenopus. "patch clamp" в застосуванні до ооцитів.
На самостійне опрацювання студентами виносяться проблеми (1 год.)
1. Способи видалення оболонок ооцита.
2. Метод макроскопічного "patch clamp".