Методи дослідження збудливих мембран
Topic outline
-
Курс «Методи дослідження збудливих мембран» є ключовим для опанування студентами сучасними методологічними підходами і фізичними приладами, що широко застосовуються в експериментальній біофізиці для дослідження транспортної та сигнальної функції клітинних мембран. Він ставить за мету розвиток у студентів навичок постановки електрофізіологічного експерименту, реєстрації біоелектричних явищ, обробки та інтерпретації одержаних результатів. Передбачається вивчення механізмів біоелектрогенезу, принципів збору та анализу електрофізіологічної інформації на макро та мікрорівнях, підходів до клонування, функціональної експресії та структурно-функціональному анализу мембранних іонних каналів та рецепторів, а також основ флуорисцентної та конфокальної мікроскопії.
Метою курсу «Методи дослідження збудливих мембран» є ознайомлення студентів з теоретичними та експериментальними підходами, які лежать в основі дослідження біоелектричної функції клітинних мемран. Вивчення курсу є необхідним етапом для закладання бази подальшої спеціалізації.
Завданням курсу є розуміння студентами теоретичних засад та опанування ними ключовими методичними підходами, які застосовуються для дослідження іон-транспортної та сигнальної функції клітинних мембран.
Інтегровані вимоги до знань та вмінь по учебовому курсу полягають в тому, що в результаті його вивчення студент повинен:
Знати:
- механизми виникнення біоелектрики та властивості біомембран;
- вимоги та принципи побудови електрофізіологічної апаратури та установки;
- фізичну хімію поведінки металів та скла в електролітах;
- принципи виготовлення та роботи електродів та мікроелектродів;
- загальні методичні підходи для електрофізіологічного дослідження клітин;
- існуючі експериментальні методики електрофізіологічного дослідження різних типів клітин та багатоклітинних препаратів;
- принципи збору, аналізу та обробки електрофізіологічної інформаціїи на макро та мікрорівнях;
- підходи до клонуванню, функціональній експресії та структурно-функціональному аналізу мембранних каналів та рецепторів;
- властивості експресійних систем для функціонального анализу клонованих каналів та рецепторів;
- використання флуорисцентних зондів для візуалізації та кількісної характеристики внутрішньоклітинних структур, біологічно активних речовин та процесів;
- основи флуорисцентної та конфокальної мікроскопії;
Вміти орієнтуватися та використовувати сучасний арсенал методичних подходів для дослідження клітинних мембран.
Місце в структурно-логічній схемі спеціальності. Вивчення дисципліни «Методи дослідження збудливих мембран» базується на засадах інтеграції теоретичних та практичних знань, отриманих студентами як в загальноосвітніх навчальних закладах (природознавство, фізика, хімія, біологія та цивільна оборона), так і одержаних при вивченні дисціплін на попередніх курсах навчання (анатомія та фізіологія, основи молекулярної фізіології).
-
1.1. Із історії біоелектрики – 3 год.
Досліди Гальвані. Перші вимірювання потенциалу пошкодження (демаркаційного потенціалу), струмів спокою та струмів дії. Розвиток методів вимірювання біопотенціалів. Теорії виникнення біоелектричних явищ.
На самостійне опрацювання студентами виносяться проблеми (4 год.)
1. Експерименти Карло Маттеучі.
2. Дифузійна теорія В.Ю. Чаговця виникнення демаркаційного потенціалу.
3. Теорія Дюбуа-Раймона, потенціал спокою і потенціал дії.
4. Досліди С. Рінгера.
1.2. Мембранна теорія – 3 год.
Етапи становлення та розвитку мембранної теорії біоелектрогенезу. Структура, функція та властивості біомембран. Підтримання іонного гомеостазу клітини: активні транспортери та іонні канали. Іонна проникність біомембран. Ряди Ейзенмана. Рівняння Нернста. Природа потенціалу спокою та потенціалу дії (ПД). Теорія постійного поля. Рівняння Голдмана-Ходжкіна-Каца. Механізми селективності іонних каналів.
На самостійне опрацювання студентами виносяться проблеми (5 год.)
1. Реотом Ю. Бернштейна, вимірювання швидкості розповсюдження ПД.
2. Ліпоідна теорія мембран Ч. Овертона.
3. Розвиток уявлень про іонну вибірковість мембран та іонні канали.
4. Досліди Б. Хілле.
5. Селективність натрієвих, калієвих і кальцієвих каналів. -
2.1. Металеві електроди – 1 год.
Фізхімія металів в електролітах. Металеві електроди, їх призначення та електрохімічні властивості. Зворотні електроди. Поляризація електродів. Рухливість іонів в электролітах. Соляні містки та дифузійні потенціали. Індиферентний електрод та способи його виготовлення.
На самостійне опрацювання студентами виносяться проблеми (2 год.)
1. Хлорсрібний електрод, електрохімічні реакції, які на ньому відбуваються.
2. Сфери використання металевих електродів у біології і медицині.
2.2. Внутрішньоклітинні вимірювання електричних потенціалів – 1 год.
Металеві мікроелектроди (МЕ): області іх вживання та недоліки. Виготовлення металевих МЕ. Скляні мікропіпетки та МЕ, їхні принципові відмінності. Структура та фізичні властивості скла. Типи скла. Фізико-хімічні властивості поверхні розділу скло/електроліт. Електричні параметри скляного МЕ та його еквівалентна схема. Типи вольт-амперних характеристик скляних МЕ. Заповнення скляних МЕ. Механічне та термічне загострення скляних МЭ. Багатоканальні скляні МЕ. Конструкція утримувача МЕ.
На самостійне опрацювання студентами виносяться проблеми (2 год.)
1. Природа виникнення потенціалу кінчика скляного МЕ.
2. Кузня Фонбрюна для виготовлення скляних мікроінструментів.
2.3. Апаратне забезпечення вимірювання біоелектричних сигналів – 1 год.
Загальна блок схема електрофізіологічної установки. Апаратура та прилади, які застосовуються в сучасних електрофізіологічних дослідженнях. Основні вимірювальні схеми. Блок схема електрофізіологічного підсилювача. Попередні підсилювачі, їх призначення та основні вимоги.
На самостійне опрацювання студентами виносяться проблеми (2 год.)
1. Операційні підсилювачі (ОП) та їх параметри.
2. Основні електрофізіологічні схеми на базі ОП.
2.4. Метод фіксації струму – 1 год.
Еквівалентна електрична схема клітини. Способи пропускання фіксованого струму через мембрану. Поняття послідовного опору та його компенсація. Схема класичного експерименту Ходжкіна-Хакслі на аксоні кальмара. Типи експериментів, які проводяться методом фіксації струму та їх інтерпретація.
На самостійне опрацювання студентами виносяться проблеми (2 год.)
1. Постсинаптичні струми та потенціали.
2. Механізм виникнення ПД.
2.5. Метод фіксації потенціалу – 1 год.
Критерії адекватності фіксації потенціалу. Просторова та часова фіксація. Роль послідовного опору при фіксації потенціалу. Одно- та двох-МЕ фіксація. Електронні схеми фіксації потенціалу. Області застосування методу фіксації потенціалу.
На самостійне опрацювання студентами виносяться проблеми (2 год.)
1. Електронна компенсація послідовного опору.
2. Пасивні заходи по зменшенню послідовного опору.
2.6. Обробка даних, одержуваних методом фіксації потенціалу – 1 год.
Способи розділення загального трансмембранного іонного струму на компоненти. Вольт-амперні характеристики (ВАХ) мембрани, миттєві ВАХ, струми втрат. Аналітичний опис ВАХ. Поняття про активацію, деактивацію та інактивацію струмів та відповідних їм каналів. Хвостовий струм. Часова та стаціонарна активаці та інактивацяя струмів, способи їх вимірбвання та опису. Віконний струм. Воротні струми. Опис фармакологічної чутливості іонних струмів. Ізотерма Ленгмюра, рівняння Хіла.
На самостійне опрацювання студентами виносяться проблеми (1 год.)
1. Експериментальні протоколи, які застосовуються для визначення біофізичних характеристик мембранних струмів.
2. Оцінка потенціалзалежності дії фармакологічних речовин на іонні струми.
2.7. Фіксація потенціалу на багатоклітинних препаратах – 1 год.
Тканини які утворюють електричний синцитій. Щільові контакти. Поодинокий та подвійний сахарозний місток. Практичні обмеження та недоліки методів сахарозного містка. Способи врахування та пониження похибок методів сахарозного містка.
На самостійне опрацювання студентами виносяться проблеми (2 год.)
1. Конексини, їх структура і функція.
2. Еквівалентна електрична схема багатоглітинного препарату.
2.8. Метод внутрішньоклітинної перфузії – 1 год.
Поєднання методів фіксації потенціалу та внутрішньоклітинної перфузії клітин. Ряд сприятливих внутршньоклітинних аніонів. Внутрішньоклітинна перфузія на основі пластикових мікропіпеток. Виготовлення пластикових мікропипеток. Послідовний опір. Модифікації метода внутрішньоклітинної перфузії. Переваги та недоліки методу фіксації потенціалу в умовах внутрішньоклітинної перфузії.
На самостійне опрацювання студентами виносяться проблеми (2 год.)
1. Способи збільшення адгезії клітин до пластику.
2. Теоретичні основи аналізу шумів з метою визначення характеристик поодиноких каналів.
2.9. Метод "patch clamp" – 1 год.
Мікроэлектроди та мікропіпетки. Метод внутрішньоклітинної перфузії із застосуванням скляних мікропіпеток, як попередник методу "patch clamp". Основні характеристики та переваги методу "patch clamp". Шляхи досягнення гігаомних контактів між кінчиком мікропіпетки та мембраною. Конфігурації методу "patch clamp". Оцінка ефективності внутрішньоклітинного діалізу в конфігурації "whole cell". Поняття про “перфорований” "patch clamp".
На самостійне опрацювання студентами виносяться проблеми (2 год.)
1. Застосування антибіотиків для “перфорації” мембрани.
2. Геометрія скляних мікропіпеток та способи її оптимізації.
2.10. Особливості електронної схеми методу "patch clamp" – 1 год.
Претворювач струм-напруга, як основний елемент попереднього підсилювача. Вимоги до опору зворотнього звязку. Корекція полоси пропускання електронної схеми. Компенсація швидких та повільних перехідних процесів. Компенсація послідовного опору.
На самостійне опрацювання студентами виносяться проблеми (1 год.)
1. Комерційно доступні підсилювачі "patch clamp", їх переваги та недоліки.
2.11. Реєстрація активності поодиноких каналів – 1 год.
Поняття про шуми та способи їх оцінки. Джерела шуму в методі "patch clamp" та шляхи підвищення його чутливості.
На самостійне опрацювання студентами виносяться проблеми (1 год.)
1. Способи покращення електричних параметрів мікропіпеток.
2.12. Компютерна обробка даних по активності поодиноких каналів – 1 год.
Пороговий детектор подій. Вплив полоси пропускання та частоти оцифровки на детекцію подій. Одержання часових та амплитудних характеристик поодиноких каналів. Пачкова активність каналів. Відповідність характеристик макроскопічних струмів та поодиноких каналів. Створення кінетичної схеми роботи каналу по даним його елементарної активності.
На самостійне опрацювання студентами виносяться проблеми (1 год.)
1. Коммерційна програма для збору та обробки даних по активності поодиноких каналів – pCLAMP.
2.13. Розвиток методу "patch clamp"– 1 год.
Високопродуктивні, роботизовані установки "patch clamp", принципи їх побудови та області застосування. Використання методу "patch clamp" для вимірювання змін ємності клітинної мембрани. Скануюча іон-провідна мікроскопія (Scanning Ion-Conductance Microscopy, SICM) на базі "patch clamp".
На самостійне опрацювання студентами виносяться проблеми (1 год.)
1. Теоретичні основи вимірювання ємності клітинної мембрани.
2.14. Вимірювання екзоцитозу та секреції – 1 год.
Оцінка екзоцитозу по змінам ємності мембрани. Карбонові електроди. Амперометричні та вольтаметричні вимірювання секреції.
На самостійне опрацювання студентами виносяться проблеми (2 год.)
1. Роль кальцію в секреції.
2. Білки, задіяні в екзоцитозі.
3. Окиснювально-відновні реакції секретованих речовин на поверхні карбонових електорадів.
-
3.1. Молекулярно білогічні підходи до дослідження іонних каналів та рецепторів – 1 год.
Генетичний код та його звязок з первинною структурою білка. Біохімічне виділення мембранних білків. Способи клонування іонних каналів та рецепторів. Бібліотеки геномної та комплементарної ДНК. Вектори ДНК.
На самостійне опрацювання студентами виносяться проблеми (3 год.)
1. Екзони та інтрони геномної ДНК
2. Сплайсинг та редагування мРНК.
3.2. Попередній аналіз клонованих каналів та рецепторів – 1 год.
Виведення первинної структури клонованого канала. Профіль гідропатичності та його звязок з топологією мембранного білка. Ідентифікація транс- та позамембранних ділянок. Змійчасті діаграми. Дендрограми гомологічних каналів.
На самостійне опрацювання студентами виносяться проблеми (3 год.)
1. Природа різноманіття однотипних каналів: гомологічні гени, альтернативний сплайсинг та редагування мРНК.
2. Метод заміщених цистеїнів.
3.3. Структурно-функциональний аналіз клонованих каналів та рецепторів – 2 год.
Основні родини клонованих каналів та рецепторів. Гомо- та гетеромультимерні канали. Ідентифікація функціонально важливих ділянок. Внесення мутацій та функціональна експресія клонованих каналів та рецепторів.
На самостійне опрацювання студентами виносяться проблеми (2 год.)
1. Основні класи та родини іонних каналів.
2. Пороутворювальні та службові субодиниці каналів.
3. Структурні ознаки потенціалкерованих каналів.
3.4. Характеристика систем для функціональної експресії экзогенних каналів та рецепторів – 1 год.
Іморталізовані клітинні лінії, їх одержання та культивування. Ооцити шпорцевої жаби Xenopus laevis, їх морфологія, процедура виділення та культивування.
На самостійне опрацювання студентами виносяться проблеми (1 год.)
1. Критерії вибору клітинних ліній, основні світові банки клітинних ліній.
2. Особливості лабораторного утримання шпорцевої жаби Xenopus laevis.
3.5. Методи введення генетичного материалу в експресійні системи – 2 год.
Способи трансфекції екзогенної ДНК в клітинні лінії. Маркери трансфекції. Транзієнтна та стабільна трансфекція. Інжекція сумарної мРНК, виділеної з різних тканин, та комплементарної мРНК клонованих каналів в ооцити Xenopus.
На самостійне опрацювання студентами виносяться проблеми (2 год.)
1. Зелений флуорисцентний білок та його похідні.
2. Умовна трансфекція.
3.6. Электрофізіологічні методи дослідження експресованих каналів та рецепторів – 1 год.
Електричні параметри ооцитів Xenopus. Двух-МЕ фіксація потенцалу на ооцитах Xenopus та її особливості. Методика "зрізаного ооцита". Метод скляної воронки для внутрішньоклітинної перфузії та фіксації потенциалу ооцитів Xenopus. "patch clamp" в застосуванні до ооцитів.
На самостійне опрацювання студентами виносяться проблеми (1 год.)
1. Способи видалення оболонок ооцита.
2. Метод макроскопічного "patch clamp".
-
4.1. Оптичні вимірювання внутрішньоклітинної концентрації кальцію – 2 год.
Перші вимірювання внутрішньоклітинної концентрації кальцію. Люмінісцентні та флуоресцентні індикатори. Характеристика сучасних флуоресцентних індикаторів кальцію. Методи введення індикаторів в клітину. Формула Гринкевича-Чена для двох хвильового методу вимірювання абсолютної концентрації кальцію.
На самостійне опрацювання студентами виносяться проблеми (2 год.)
1. Індикатори примембранної та органельної концентрациї кальцію.
2. Калібрування установки для вимірювання концентрациї кальцію.
4.2. Інші флуоресцентні індикатори – 1 год.
Індикатори потенціалу. Використання зеленого флуорисцентного протеїну та його похідних для візуалізації каналів та рецепторів.
На самостійне опрацювання студентами виносяться проблеми (2 год.)
1. Флуоресцентні маркери мембрани та огранел.
2. Поняття про каналородопсин.
4.3. Флуоресцентний мікроскоп – 1 год.
Блок схема флуоресцентного мікроскопа. Блок схема установки для флуоресцентних досліджень динамічних процесів. Суміщення флуорометричних та електрофізіологічних досліджень.
На самостійне опрацювання студентами виносяться проблеми (2 год.)
1. Поняття про TIRF мікроскопію.
2. Оптичний "patch clamp".
4.4. Принципи конфокальної мікроскопії – 1 год.
Одно- та двохфотонний конфокальний мікроскопи, переваги та недоліки кожного з них. Дослідження ко-локалізації мембранних білків з використанням резонансного переносу енергії.
На самостійне опрацювання студентами виносяться проблеми (2 год.)
1. Теоретичні основи резонансного переносу енергії.
2. Використання антитіл в імунофлуорисцентних дослідженнях.
4.5. Методи надшвидкого прикладання розчинів з використанням "caged" біологічно активних речовин – 1 год.
Методи надшвидкої зміни розчинів в електрофізіологічному експерименті. Поняття про "caged" речовини. Вимоги до "caged" речовин. Способи введення "caged" речовин в клітину.
На самостійне опрацювання студентами виносяться проблеми (2 год.)
1. Типи "caged" речовин.
2. Електрофізіологічні експерименти з використанням "caged" речовин.
-
Навчально-методичні матеріали
HighlightedЕлектрофізіологія в історичному контексті:
●Verkhratsky A, Krishtal OA, Petersen OH. "From Galvani to patch-clamp: the development of electrophysiology", Pflugers Arch. 453:233-247, 2006. [у вільному доступі]
●Verkhratsky A, Parpura V. "History of electrophysiology and the patch clamp", Methods Mol Biol. 1183:1-19, 2014.
Електроди:
●Purves RD. “Microelectrode methods for intracellular recording and ionophoresis”, Lond., N.-Y. etc., Academic Press, 1981.
Біофізика іонних каналів і електрофізіологія в широкому контексті:
●Збірник методичних статей "Ion channels" в книжковій серії “Methods in Enzymology”, v. 207, Academic Press, 1992.
●Hille В. "Ion channels of excitable membranes", 3rd Edition, Sunderland MA, Sinauer Associates Inc., 2001.
●Костюк ПГ, Зима ВЛ, Магура ІС, Мірошниченко МС, Шуба МФ. “Біофізика”, Київ, Обереги, 2001.
●Ogden DC, editor. "Microelectrode techniques, the Plymouth workshop handbook". 2nd Edition, Cambridge, UK, Company of Biologists, 1994.
Аналіз мембранних струмів:
Standen NB, Davies NW, Langton PD. "Separation and analysis of macroscopic currents", 1994. http://www.utdallas.edu/~tres/microelectrode/microelectrodes_ch03.pdf
Внутрішньоклітинна перфузія:
●Kostyuk PG, Krishtal OA. “Intracellular perfusion of excitable cells”, New York. John Wiley & Sons, Ltd., 1984.
Фіксація потенціалу на багатоклітинних препаратах:
●Mert T. "Sucrose-gap technique: advantages and limitations" Neirofiziologiya/Neurophysiology, 39(3);270-274, 2007.
Patch-clamp:
●Hamill OP, Marty A, Neher B, Sakmann B, Sigworth FJ. "Improved patch-clamp techniques for high-resolution current recording from cells and cell-free membrane patches", Pflugers Arch. 391:85-100, 1981.
●DeFelice LJ. "Electrical properties of cells. Patch-clamp for biologists", New York and London. Plenum Press, 1997.
●Molleman A. "Patch clamping. An introductory guide to patch-clamp electrophysiology", John Wiley & Sons, Ltd. West Sussex, 2003.
●“The Axon CNS guide to electrophysiology & biophysics laboratory techniques”, http://student.ulb.ac.be/~dgall/Axon_Guide.pdf [у вільному доступі]
Змістовий модуль №3:
●Шуба ЯМ. "Основи молекулярної фізіології іонних каналів", Київ, Наукова думка, 2010.
Оригінальні журнальні статті та огляди.
Матеріали інтернету.
-
1). Кріоелектронна мікроскопія (Cryogenic Electron Microscopy) у застосуванні до іонних каналів: принципи, переваги, приклади.
2). Поняття про TIRF (total internal reflection fluorescence) мікроскопію та оптичний петч-клемп: принципи, переваги та недоліки, приклади успішного застосування.
3). Поняття про caged-речовини: типи, особливості структури та застосування при дослідженні іонних каналів і рецепторів.
4). Каналродопсин (channelrhodopsin, ChR1-2), галородопсин (halorhodopsin), їх рекомбінантні різновиди, та оптогенетика.
5). Механочутливість клітин ссавців, типи іонних каналів, задіяних у механочутливості, механочутливі канали з родини PIEZO: відкриття, розповсюдження, способи активації і дослідження.
6). Механочутливі канали з родини PIEZO: будова та принципи функціонування по результатам досліджень структури.
7). Кальцій-активовані хлорні канали та їх представник anoctamin 1 (ANO1, альтернативне позначення TMEM16A).
8). Регуляція клітинного об'єму, та участь у ньому об'ємрегульованого аніонного каналу (VRAC – volume-regulated anion channel) LRRC8A (leucine-rich repeats-containing 8A, альтернативне позначення SWELL1).
9). Автоматизація електрофізіологічних досліджень – high-throughput electrophysiology: принципи побудови установок, їх типи, призначення, досягнення і недоліки.
10). Натрієвий канал втрат (NALCN, sodium leak channel, non-selective): відкриття, будова, розповсюдження, фізіологічна роль.
11). Водні канали аквапорини (aquaporins): відкриття, типи, будова, розповсюдження, фізіологічна роль.
12). Кальційпроникні іонні канали ендоплазматичного ретикулума – ріанодінові та інозитолтрифосфатні рецептори: особливості будови, експресії, активації фізіологічної ролі при вивільненні внутрішньоклітинного кальцію.